La tuberculose et le laboratoire : méthodes, résultats

Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie, Centre de Biologie Médicale.

Le laboratoire est au centre de la stratégie de lutte :

Extrait des normes internationales applicables au traitement de la tuberculose (La Haye, 2005) :

• Un diagnostic rapide et exact et un traitement efficace font partie intégrante de soins de qualité. 
• Norme 2. Tous les malades (adultes, adolescents ou enfants capables de produire des expectorations) présumés atteints de tuberculose pulmonaire devront donner au minimum 2, de préférence 3, échantillons pour un examen microscopique des expectorations. Un échantillon devra être obtenu si possible tôt le matin.

La phase dite « pré-analytique » : 
 Des prélèvements corrects pour garantir des résultats significatifs

Prélèvements biologiques étudiés

Seules les expectorations et les tubages gastriques permettent d’identifier les malades bacillifères. L’expectoration doit contenir des mucosités, un crachat salivaire est sans intérêt. : Pour cela, on doit assister le patient et lui apprendre à cracher. Le tubage gastrique permet de récupérer les crachats déglutis pendant le sommeil lorsque l’obtention de mucosités est impossible (Jeunes enfants notamment)

Le recueil doit se faire dans des pots non stériles, à ouverture large à couvercle à vis ou cliquet et dont la solidité peut supporter le transport (plastique).

Pour les recherches extra pulmonaires, les fluides biologiques ou biopsie sont acceptables, reçus en pot stérile et non sur écouvillon.

Les échantillonsts doivent être identifiés : état-civil, date, prescripteur, et accompagnés de la prise en charge si il sont transmis par un tiers.

Si le prélèvement ne doit pas être mis en culture, il peut être conservé à température ambiante.

Si une culture est demandée, il doit être conservé et transporté à +4°C sans excéder une semaine entre le recueil et l’ensemencement.

Fermer soigneusement les pots, insérer dans une pochette plastique, documents à l’extérieur.

Les malades doivent être prélevés lors du diagnostic puis au 2ème mois de traitement lors du passage de la quadrithérapie à la bithérapie et enfin lors de l’arrêt du traitement pour différencier les échecs, des guérisons ou traitements complets. Lorsque le diagnostic est acquis, les prélèvements des patients bacillifères entre le diagnostic et le 2ème mois ne sont pas nécessaires.

Il s’agit de la recherche de BAAR (Bacilles Acido-Alcoolo Résistants), caractéristique des Mycobactéries, dont fait partie le bacille de Koch (BK), ou Mycobacterium tuberculosis, responsable de la Tuberculose. 

- est évocateur, il est rendu en moins de 24 h, mais ne certifie pas à lui seul la tuberculose puisqu’il existe d’autres mycobactéries non tuberculeuses,

- signe le caractère bacillifère (= Contagieux) dans les crachats & tubages,

- apprécie la densité bacillaire.

Méthodes utilisées au laboratoire :

- détection initiale (criblage) coloration à l’ Auramine (microscope à épi-fluorescence)

- confirmation par la coloration de Ziehl-Neelsen (coloration destinée à mettre en évidence le caractère acido-alcoolo-résistant des mycobactéries)

Un microscopiste peut lire environ 25 à 30 lames par jour. En cas de négativité il faut lire 300 champs (<3 b. / 300 champs).

Aspect de Mycobacterium tuberculosisà l’examen direct :		Coloration à l’Auramine Coloration de Ziehl-Neelsen

Les mises en cultures se pratiquent après une phase de décontamination des prélèvements (élimination des bactéries banales à pousse rapide). On utilise des milieux spéciaux (Lowenstein-Jensen et Coletsos). Le délai moyen de pousse est de 28 jours. Les cultures sont examinées du 5^ème au 84^ème jour, avant d’être rendues négatives au-delà de ce délai.
Les cultures permettent le dénombrement des colonies (richesse de l’inoculum) et l’étude de la vitesse et de la température optimale de croissance sont les premiers caractères orientant vers l’identification.

	Travail sous poste de sécurité microbiologique de niveau 2 pour la manipulation du bacille de la Tuberculose
Colonies de Mycobactéries sur milieu de Lowënstein

 

Les tests mis en œuvre nécessitent une quantité importante de germes entrainant de nouveaux délais de réponse.

Le laboratoire utilise deux approches analytiques :

- les tests biochimiques (mise en évidence de l’équipement enzymatique du BK) et culturaux (Aspect, vitesse, croissance en présence d’inhibiteurs)

- les sondes d’hybridation (en une heure sur culture suffisante)
qui consiste à identifier une portion spécifique de l’ADN du bacille de Koch à l’aide de techniques de biologie moléculaire.

L’antibiogramme permet de tester la sensibilité du bacille tuberculeux (BK) aux traitements (association de plusieurs antibiotiques).

Il est réalisé sur tubes de Löwenstein-Jensen imprégnés d’antibiotiques à différentes concentrations : Isoniazide, Ethambutol, Rifamycine et Streptomycine.

Cet examen est long et fastidieux, mais il n’existe pas actuellement d’alternatives automatisées satisfaisantes adaptées à la taille de la population Calédonienne (coût disproportionné).

Il faut près d’un mois après l’identification pour détecter une résistance, l’antibiogramme est donc un des moyens pour contrôler l’efficacité du traitement et guide éventuellement les modifications à apporter.

En cas de traitement efficace, la contagiosité est très rapidement diminuée et considérée comme nulle après 2 à 3 semaines. Ce cas se traduit par un examen direct à 2 mois BAAR négatif ou douteux associé à une réponse clinique (Amélioration des signes).

Les malades dont les frottis de crachats sont négatifs à l’examen direct mais les cultures positives sont peu ou pas contagieux. Cependant, le risque de transmission reste possible lorsqu’il existe une toux importante.

• L’examen direct est la clef du diagnostic : obtenu en 24 h, il est plus informatif que la radiographie pulmonaire, car il identifie les bacillifères. Il doit être répété 3 fois pour s’assurer du résultat. Il n’est toutefois qu’une indication, car sa sensibilité par rapport à la culture n’est que de 25 à 65% sur des prélèvements d’origine pulmonaire. Il faut 104 bacilles par ml pour qu’un frottis soit positif. La mise en culture est donc systématique, mais les résultats sont plus tardifs, et viennent confirmer la plupart du temps un diagnostic déjà posé sur un faisceau de présomptions (Clinique, radiologie…)
  

•  Non pratiqué face à toute culture positive les indications de l’antibiogramme doivent être discutées :
• au plan individuel : il est limité aux échecs de traitements et aux patients à haut risque d’infection par une souche résistante,
• au plan collectif : des enquêtes de cohorte sont faites tous les 3 à 5 ans pour évaluer la prévalence de la résistance du bacille tuberculeux aux antibiotiques : en 1996 (<1%) et en 2001 (3.2%).

En raison de cette tendance, il a été décidé qu’en Nouvelle-Calédonie, un antibiogramme serait pratiqué sur chaque nouveau cas.

Le taux de résistances primaire est un indicateur de la qualité du traitement appliqué dans la collectivité, il dépend du réservoir de germes résistants présent chez les patients déjà traités mais non guéris.

Le taux de résistances secondaires (acquises au cours de la maladie) mesure les erreurs humaines dans la conduite du traitement (posologie, compliance, rupture d’approvisionnement), il est plus élevé que le taux de résistances primaires.

Le laboratoire de l’Institut Pasteur, le seul à pratiquer l’identification et l’antibiogramme, reçoit environ 5000 prélèvements par an. Ses données ont ainsi une exhaustivité territoriale certaine.

•  Liens vers les archives de surveillance annuelle (extraits des rapports techniques de l’IPNC)