DenVect

Acronyme: DenVect Compétence vectorielle d’Aedes aegypti pour les virus de la dengue, Nouvelle-Calédonie
Checheur principal O. O’Connor
Point focal IPNC O. O’Connor, M. Dupont-Rouzeyrol
Collaborateurs IPNC C. Inizan, N. Pocquet
Budget 8380 € Budget devoted to IPNC:
Financement IPNC
Agenda Date de début : Août 2016 Date de fin:  Juillet 2017
Contexte
La survenue des épidémies de dengue nécessite trois acteurs clés : l’agent pathogène (c’est-à-dire le virus), le vecteur (Aedes sp.) et l’hôte humain. En Nouvelle-Calédonie, Ae. aegypti est le principal vecteur (le seul avéré à ce jour) des arbovirus. Depuis la Seconde Guerre mondiale, la NC a été régulièrement touchée par des épidémies de dengue avec une circulation cyclique des quatre sérotypes de DENV. Cependant, au début de l’an 2000, ce modèle a changé avec la persistance du DENV-1. Ces observations suggèrent que notre vecteur local est compétent pour le DENV. Cependant, sa capacité à être infecté par le DENV, lui permettant de reproduire et de transmettre le virus à l’hôte humain, n’a pas encore été étudiée.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la capacité des Ae. aegypti néo-calédoniens à transmettre les différents sérotypes DENV, en lien avec le profil épidémiologique observé.
Méthodes
 

Sélection des souches de DENV à partir de la bio-banque et production des stocks viraux : une souche du DENV de chaque sérotype/génotype sera sélectionnée dans la bio-banque de l’IPNC selon l’année épidémique de circulation. Celles-ci seront amplifiées sur cellules C6/36 (pas plus de 3 passages). La quantification virale se fera par immunofluorescence sur cellules C6/36.

Caractérisation phénotypique des souches de DENV représentatives chez le vecteur : une population de génération F1 d’Ae. aegypti sera utilisée pour les études de compétence vectorielle menées sur chaque souche de DENV sélectionnées. Deux expériences indépendantes seront réalisées avec toutes les souches virales. Les taux d’infection, de dissémination et de transmission seront mesurés à 7 et 14 jours post-gorgement. L’analyse des échantillons sera réalisée comme précédemment.

Résultats
Les stocks viraux de DENV 1 à 4 ont été réalisés et les virus ont été caractérisés phylogénétiquement. Les deux expériences indépendantes de compétence vectorielle ont été menées sur l’ensemble des souches de DENV. L’analyse des indices mesurés est en cours. Les résultats préliminaires obtenus sur la première expérience montrent que le vecteur calédonien est capable de transmettre le DENV. Une transmission du DENV-1/GI et du DENV-4 est observée dès 7 jours post-infection avec des taux respectifs de 20% et 33%. A 14 jours post-infection, une efficacité comprise entre 12,5 et 22% est observée pour l’ensemble des souches de DENV.
Perspectives
En Nouvelle-Calédonie, le contexte est particulièrement bien adapté pour étudier la dynamique de transmission de la dengue étant donné qu’Ae. aegypti est le seul vecteur avéré et que nous avons une bonne connaissance de l’épidémiologie de la dengue. Ainsi, ce projet nous permettra d’avoir une vision globale de la capacité vectorielle d’Ae. aegypti à un moment donné, ce qui est un point important pour mieux comprendre la transmission et la dynamique des épidémies de dengue en Nouvelle-Calédonie.

DenGen

Acronyme: DenGen

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Remplacement du génotype du virus de la dengue: étude des différences virales conduisant à l’évolution des épidémies de dengue

 

Chercheur principal M. Dupont-Rouzeyrol
Focal point IPNC O. O’Connor / M. Dupont-Rouzeyrol
Collaborateurs IPNC N. Pocquet
Autres collaborateurs L. Lambrechts (IP), V. Duong (IPC), P. Dussart (IPC)
Budget 50 000 € Budget devoted to IPNC: 21 200 €
Financements Actions Concertées Inter Pasteuriennes (ACIP)
Timeline Date de début : Jan 2017 Date de fin : December 2018
Contexte
Des analyses phylogénétiques ont révélé que la dynamique évolutive du virus de la dengue (DENV) est souvent caractérisée par le remplacement d’un génotype du DENV par un autre génotype du même sérotype. De tels remplacements génotypiques sont épidémiologiquement significatifs car ils peuvent être associés à des modifications de la sévérité de la maladie et de l’immunité humaine. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ce renouvellement du génotype de DENV dans la nature restent mal définis.
Objectifs
Les objectifs spécifiques de cette étude, menée dans deux contextes épidémiologiques différents: une zone hyper-endémique: Cambodge, et une zone épidémique: Nouvelle-Calédonie (NC), sont : i) étudier in vivo le rôle potentiel de la sélection dirigée par le vecteur dans les remplacements génotypiques du DENV ; ii) étudier in vitro la capacité relative des génotypes du DENV à se répliquer et à produire des ARN subgénomiques du flavivirus.
Méthodes
 

Dynamique évolutive du DENV en NC et au Cambodge: environ 20 souches par an depuis 2009 seront sélectionnées. Le gène E sera séquencé afin de déterminer l’appartenance du génotype. Sur la base de ces résultats, cinq souches représentatives par sérotype / génotype seront sélectionnées pour le séquençage du génome entier.

Fitness compétitive du DENV in vivo par des analyses de compétence vectorielle: Deux souches de DENV par génotype seront sélectionnées pour l’expérience de compétition. Une génération F1 ou F2 d’Ae. aegypti sera mise en contact avec différents ratios des deux souches du DENV. Les taux d’infection, de dissémination et de transmission seront mesurés aux jours 7 et 14 après l’exposition. La quantification virale des deux génotypes sera effectuée par RT-qPCR.

Fitness réplicatif du DENV in vitro: La cinétique de réplication de souches représentatives du DENV et la production de sfRNA seront observées pendant 5 jours sur des cellules de mammifères. La quantification de l’ARN sera effectuée comme précédemment.

Résultats
Toutes les souches du DENV (NC et Cambodge) ont été obtenues après moins de trois passages sur des cellules C6/36. Elles ont toutes été envoyées à l’IP pour le séquençage à haut débit du génome complet. Celui-ci est en cours de réalisation.
Perspectives
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes évolutifs qui sous-tendent les remplacements de génotypes du DENV typiquement observés au cours des épidémies de dengue.

Sévérité de la dengue 2017

Dengue 2017, Investigations des cas sévères : Dengue Sévérité
Chercheur principal M. Dupont-Rouzeyrol
Point focal IPNC  M. Dupont-Rouzeyrol
Collaborateurs IPNC A. Tarantola, C. Inizan, M. Minier, O. O’Connor
Autres collaborateurs E. Simon-Lorière, A. Sakuntabhai (IPP), E. Descloux, M. Sérié, M.-A. Goujart,, A.-C. Gourinat (CHT), C. Forfait, A. Pfannstiel (DASS-NC).
Budget Budget devoted to IPNC 
Financements IPNC, IPP, CHT, NC
Calendrier Date de début : Sept.2017 Date de fin : Sept. 2018
Contexte
Avec 4 401 cas de dengue (2 548 confirmations biologiques), 579 cas hospitalisés et 11 décès entre le 1er Janvier et le 8 Octobre 2017, l’épidémie de dengue 2016-2017 en Nouvelle-Calédonie (NC) était considérable. De plus, elle était associée à un pourcentage accru d’admission à l’hôpital et des présentations cliniques sévères (atteintes hépatiques, complications ophtalmiques…) L’augmentation du nombre de décès et a fortiori les formes hépatiques rares observées au cours de cette épidémie pourraient être liées à des caractéristiques particulières des virus, des patients ou encore de la réponse hôte-pathogène.
Objectifs
Déterminer dans quelle mesure les présentations sévères d’infection par le virus de la dengue étaient associées à des caractéristiques particulières telles que le génotype viral et son tropisme hépatique, les comorbidités des patients ou encore des infections antérieures par les virus de la dengue et du Zika.
Méthodes
La poursuite de leur participation ainsi qu’un échantillon sanguin supplémentaire seront demandés aux patients déjà inclus dans l’étude ArboVirtuess.

-Sélection de 50 séra de 2017 et des années antérieures : 1/3 de formes sévères versus 2/3 de formes non-sévères

-Etudes phylodynamiques basées sur un séquençage en génome complet. Recherche de variations des quasi-espèces virales

-Analyse comparative du tropisme hépatiques des souches virales représentatives de l’épidémie de 2016-2017 versus celles des années antérieures

-Caractérisation des séra : historique d’infections antérieures par des arbovirus, impact d’une immunité humorale préexistante sur la réplication du virus de la dengue dans des monocytes humains (ADE)

Résultats préliminaires
L’approbation éthique pour le rappel des patients a été obtenu et les séra ont été sélectionnés et collectés. Les ARN viraux ont été extraits des séra et le séquençage de leurs génomes complets est en court. En parallèle, les virus contenus dans ces séra sont en cours d’isolation sur cellules de moustique C6/36 et seront prochainement titrés. Les conditions expérimentales de l’infection des cellules hépatiques et de l’ADE ont été mises au point et sont en cours de validation. La caractérisation du tropisme hépatique des virus et la capacité inhibitrice/potentialisante des séra sera prochainement initiée.
Perspectives
Cette étude pourra mettre en évidence une évolution des virus responsables des cas sévères par rapport aux cas non-sévères, en lien avec une modification de leur tropisme hépatique. De plus, ce projet fournira une caractérisation inédite de l’impact des anticorps anti-Zika sur l’infection par le virus de la dengue. Dans l’ensemble, ce projet permettra de comprendre pourquoi l’épidémie de dengue de 2017 a été inhabituellement sévère. L’étude de l’influence d’une immunité anti-Zika préexistante sur la sévérité de la dengue pourra être utile aux territoires présentant une situation épidémiologique similaire, suggérant un nouvel indicateur permettant d’estimer le risque de progression vers une dengue sévère.

VIP

Acronyme: VIP Les particules défectives interférentes de la dengue sont-elles interférentes? 
Chercheur pincipal C. Inizan
Point focal IPNC C. Inizan / M. Dupont-Rouzeyrol
Collaborateurs IPNC O. O’Connor
Autres collaborateurs  
Budget 8 275 € Budget devoted to IPNC  : NA
Financements IPNC
Agenda Date de début :Mars 2017 Date de fin : Février 2018
Contexte
Au cours de la réplication virale, des erreurs de la polymérase peuvent générer des génomes incomplets, qui sont encapsidés dans des Particules Virales Défectueuses (PVD). Répliquées et propagées lors de la co-infection avec des virions fonctionnels, ces PVD peuvent affecter la physiopathologie de l’infection : inhibition de la réplication virale, modulation de la réponse immunitaire de l’hôte et contribution à la persistance de l’infection. Dans le cas du virus de la dengue (DENV), des PVD ont été détectées à la fois chez les humains et les moustiques Aedes vecteurs de l’infection. Elles pourraient constituer un régulateur naturel de la virémie des patients, et ainsi influer sur le devenir et la résolution de l’infection.
Objectifs
Cette étude vise à évaluer le rôle des PVD dans la régulation de la virémie chez les patients. Elle se base sur (1) la caractérisation et la quantification des PVD dans des séra de patients de la dengue, en lien avec leur virémie, et (2) la mesure in vitro de l’impact des PVD sur la réplication du DENV.
Méthodes
Caractérisation moléculaire des PVD dans des séra de patients de la dengue en Nouvelle-Calédonie :

-Evaluation de la virémie des patients par infections in vitro et PCR en temps réel

-Quantification et analyse du « profil » des ARN subgénomiques des PVD présents dans les séra des patients par PCR en temps réel

– Séquençage des ARN subgénomique des PVD présents dans les séra des patients

Mesure in vitro de la modulation de la réplication du DENV par les PVD :

-Production et purification de PVD par infections in vitro et ultracentrifugation

-Quantification par PCR en temps réel de l’impact des PVD sur la réplication in vitro du DENV en cellules humaines

Résultats préliminaires
Le titre viral infectieux de cinquante séra de patients de Nouvelle-Calédonie infectés par le génotype I du sérotype 1 du DENV a été évalué par des infections in vitro. En parallèle, l’ARN viral a été extrait de ces séra. Les analyses de biologie moléculaire sont en cours de mise au point et devraient permettre de prochainement quantifier et séquencer les ARN subgénomiques des PVD.
Perspectives
Par l’implémentation d’outils de détection et de purification des PVD, ce projet ouvre la voie à une étude plus large sur le rôle des PVD dans le cycle naturel du DENV, qui mesurera leur impact sur la physiopathologie et la transmission du DENV. L’étude de l’impact des PVD sur la virémie permettra d’envisager leur quantification dans le sérum des patients comme un outil pronostic de la sévérité de l’infection.

R_Zero

Acronym : R-Zero Risk factors for Zika virus Emergence and Recurrent Outbreaks within the Pacific area.
Checheur Principal  VM. Cao-Lormeau (ILM)
Point focal IPNC  M. Dupont-Rouzeyrol
IPNC collaborateurs D. Girault, A. Tarantola
Autres collaborateurs Ministère de la santé de Fidji, Samoa et Yap, Institut Pasteur, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Queensland University of Technology
Budget 32 000€
(phase 1)
Budget alloué à l’IPNC  3 000 €
Financements Fonds Pacifique + chaque institution
Agenda date de début : Juillet 2017 date de fin : Juillet 2018 
Contexte
En 2014, le Zika (ZIKV) émergeait dans la région Pacifique et diffusait dans le monde. Début 2016, l’OMS a déclaré l’épidémie de ZIKV une urgence de santé publique internationale en lien avec les conséquences neurologiques graves observées suite à une infection par le ZIKV. Depuis, le nombre de pays ayant déclaré une épidémie de Zika n’a eu de cesse d’augmenter, illustrant que l’expansion géographique du ZIKV est un processus toujours en cours et ce même dans la région. De plus, la réapparition du ZIKV dans les Etats Fédérés de Micronésie, à Kosrea, 8 ans après l’épidémie de Yap, illustre le risque de récurrence d’épidémie dans des zones précédemment exposées.
Objectifs
Le présent projet a pour objectif global d’identifier les facteurs de risque d’émergence et de récurrence d’épidémies de Zika dans le Pacifique, en se focalisant plus particulièrement sur l’immunité de communauté anti-Zika.
Méthodes
 

Caractérisation de la réponse immunitaire mémoire contre le ZIKV – persistance et possible interférence avec la dengue

Immunité de communauté contre le ZIKV – statut et évolution dans 4 sites du Pacifique

Dynamique épidémique du Zika – facteurs de risque d’émergence et de récurrence d’épidémie

Perspectives
Ce projet doit contribuer à apporter des informations cruciales sur la persistance de l’immunité protectrice contre le virus Zika chez des patients infectés. Il doit également permettre d’évaluer le niveau d’exposition et d’immunité des populations du Pacifique au virus Zika.
Valorisation 
Communication : M. Dupont-Rouzeyrol, R-Zero Workshop, Tahiti, 2017 (Oral)

ZikAlliance

Acronyme : ZikAlliance Alliance mondiale pour le contrôle du virus  Zika et sa prévention.

https://zikalliance.tghn.org/

Chercheur principal X. de Lamballerie (Inserm)
Point focal IPNC M. Dupont-Rouzeyrol
Collaborateurs IPNC N. Pocquet, O. O’Connor, M. Minier
Autres collaborateurs AB. Failloux (IP), ZikAlliance consortium, task 6.2
Budget 11.9M€ Budget devoted to IPNC: 30 000 €
Financements H2020
Agenda Date de début :Jan. 2017 Date de fin : Decembre2019
Contexte
En 2014, le Zika (ZIKV) émergeait dans la région Pacifique et diffusait dans le monde. Début 2016, l’OMS a déclaré l’épidémie de ZIKV une urgence de santé publique internationale en lien avec les conséquences neurologiques graves observées suite à une infection par le ZIKV. Le projet ZikAlliance est un vaste projet qui a pour objectifs d’étudier le virus Zika et ses conséquences à différentes échelles et à travers différents environnements. L’IPNC est partenaire de ce projet et est impliqué dans le WP6 : Vecteurs et plus particulièrement la partie compétence vectorielle. Les objectifs présentés ici correspondent uniquement à la tâche dans laquelle l’IPNC est partenaire.
Objectifs
Evaluer la compétence vectorielle de différents moustiques, de différents environnements (Amérique, Asie, Europe, Pacifique) pour différentes lignées de virus Zika.
Méthodes
 

 

Homogénéisation des protocoles.

Génération des populations F1 d’Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus de Nouvelle-Calédonie.

Production des stocks de virus Zika, différentes lignées.

Réalisation des expériences d’infections expérimentales : mesure des paramètres infection, dissémination et transmission.

Analyse des résultats à l’échelle globale.

Résultats
Deux populations d’Ae. aegypti (Nouméa et Koné) ont été récoltées et générées. Les ZIKV lignée africaine et lignée asiatique/américaine ont été réceptionnés. Les infections expérimentales sont programmées pour le premier semestre 2018.
Perspectives
Mieux connaître la capacité de transmission des différents vecteurs pour les différentes lignées est nécessaire à l’évaluation du risque et à la mise en place de méthodes de lutte et de prévention plus ciblées et plus performantes.
Valorisation
Publications : Dupont-Rouzeyrol et al, In press, Calvez et al, submitted ; Boyer et al, submitted; Simon et al, submitted ; Calvez et al, in prep.