Identification des leptospires par Maldi-Tof

Maldi-Tof identification of Leptospira spp.
Chercheur principal Cyrille Goarant
Point focal IPNC Dominique Girault, Cyrille Goarant
Collaborateurs  IPNC Roman Thibeaux, Malia Kainiu, Julien Colot
Budget 1 000 euros Budget devoted to IPNC : NA
Financements IPNC
Agenda Date de début2015 Date de fin : 2019

Contexte

L’IPNC a acquis un automate de spectrométrie de masse couplé à un logiciel permettant, par comparaison avec une base de données de spectres de référence, l’identification des bactéries. Ce système, rapide et fiable, est maintenant utilisé en routine pour la microbiologie médicale. Nous avons voulu utiliser ce système pour identifier les bactéries du genre Leptospira.

Objectifs

Les objectifs étaient de créer une base de données de spectres de masse de souches de référence du genre Leptospira, puis d’utiliser celle-ci pour contrôler l’identification des souches utilisées pour la sérologie MAT ainsi que des souches inconnues.

Méthodes

Une revue bibliographique a permis d’identifier 3 équipes ayant créé des spectres de masse de bactéries du genre Leptospira. Les auteurs correspondants des articles ont été contactés et sollicités pour partager leur base de données de spectres de masse. Le Dr Anna Rettinger de l’Université de Munich a accepté de transmettre ses spectres de référence.

Nous avons également créé des spectres de référence de toutes les espèces connues. Des souches inconnues (isolats de patients) ou connues (souches du panel MAT de sérologie) ont ensuite été identifiées à l’aveugle.

Enfin, des isolats environnementaux de Nouvelle-Calédonie appartenant à des espèces nouvelles ont été analysés avec la même technique.

Résultats

Les essais préliminaires ont permis d’optimiser la technique de préparation des leptospires pour lecture de leur spectre de masse sur le Maldi-Tof Bruker. Les spectres de référence de souches représentant les 35 espèces connues de Leptospira ont été créés et regroupés dans une base de données « recherche » dédiée.

L’analyse à l’aveugle de souches montre une très bonne fiabilité pour l’identification au niveau de l’espèce, mais une précision insuffisante pour identifier au niveau individuel les souches utilisées comme antigènes pour la sérologie MAT. Les souches isolées de patients ont toutes été identifiées au niveau de l’espèce avec des scores élevés considérés comme diagnostiques.

Perspectives

La base de données de spectres de référence des Leptospira est en ce moment enrichie en continu pour inclure toutes les espèces validement décrites.

Valorisation 

Thibeaux R, Girault D, Bierque E, Soupé-Gilbert ME, Rettinger A, Douyere A, Meyer M, Iraola G, Picardeau M, Goarant C, 2018. Biodiversity of environmental Leptospira: improving identification and revisiting the diagnosis. Front. Microbiol. 9: 816.

Communication grand public par l’Institut Pasteur

 

Survie des leptospires dans l’eau

Survie de leptospires pathogènes dns des eaux pauvres en nutriments: vers une meillere connaissance du réservoir environnemental des leptospires.
Principal investigator Emilie Bierque
Focal point IPNC Emilie Bierque, Cyrille Goarant
Collaborators at IPNC Marie-Estelle Soupé-Gilbert, Malia Kainiu
Other Collaborators Stagiaires
Total budget of project 8 300 euros Budget devoted to IPNC: NA
Funding IPNC
Timeline Start date: 2016 End date: 2019
Contexte
La transmission de la leptospirose à l’homme se fait par l’exposition à des leptospires virulents par contact avec l’urine ou les tissus d’animaux infectés, le plus souvent indirectement via un réservoir hydrotellurique. Pourtant, les facteurs conditionnant la survie des leptospires pathogènes dans l’environnement demeurent très mal connus.
Objectifs
L’objectif est de décrire la survie de leptospires dans des eaux de différentes compositions minérales.
Méthodes
Notre expérimentation utilise des eaux stérilisées pour étudier l’effet de la composition ionique des eaux testées sans les interactions complexes qui pourraient se produire dans la microflore multi-spécifique. Pour éviter la précipitation des sels qui se produirait lors de l’autoclavage et modifierait la composition ionique, les eaux ont été stérilisées par une filtration à 0,1 μm en utilisant des cartouches jetables stériles, puis distribuées dans des flasques de culture en plastique de 50 mL avec 2 lamelles de verre stériles pour évaluer l’adhérence des leptospires et observer d’éventuels changements morphologiques. Des leptospires sont ajoutés dans chaque flasque à une concentration finale de 106 Leptospires / mL. Les flacons de culture sont incubés à 30°C à l’obscurité, puis prélevés après différentes durées d’incubation, pendant un maximum de 2 ans.
Résultats
Après douze mois d’expérimentation, les résultats révèlent différents taux de survie selon l’eau utilisée, dès 30 jours d’incubation. Nous observons une différence de comportement entre les souches de leptospires seulement pour l’eau la plus minéralisé. Deux eaux semblent permettre une meilleure survie de trois des quatre souches étudiées. De plus, l’eau la plus minéralisée semble devenir favorable à la survie d’une des souches au bout d’un an de survie. Les trois souches restent vivantes et virulentes (pour les pathogènes) après au moins 9 mois en eaux alors que la quatrième n’a pas survécu après seulement deux jours. La microscopie nous permet également d’observer la formation d’amas cellulaires à partir de 60 jours d’incubation pour les pathogènes et dès 2 jours pour la souche saprophyte.
Perspectives
Notre étude permettra d’identifier la composition ionique des eaux favorisant la survie des leptospires et ainsi acquérir des données importantes sur leur survie et le maintien de la virulence dans des conditions pauvres en nutriments, l’environnement aqueux constituant la principale source de contamination humaine.
Valorisation 
Mélanie Faure, L2 student at University of New Caledonia made a 2-month training period on this subject.

Bierque E, Soupé-Gilbert ME, Geroult S, Thibeaux R and Goarant C. Leptospira survival in freshwater microcosms. Poster at the ILS conference, Palmerston North, NZ, November 2017.

 

Biofilm et leptospires

Leptospira Biofilm: an unexplored reservoir for environmental survival and persistence of infectious bacteria.
Principal investigator Roman Thibeaux
Focal point IPNC Roman Thibeaux, Cyrille Goarant
Collaborators at IPNC Marie-Estelle Soupé-Gilbert, Dominique Girault, Emilie Bierque
Other Collaborators Mathieu Picardeau, IPP, Jean-Marc Ghigo, IPP, Michaël Meyer, UNC
Total budget of project 8000 euros Budget devoted  to IPNC : NA
Funding IPNC
Timeline Start: 2018 End : 2019

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’étudier le rôle protecteur que le biofilm confère aux leptospires pathogènes à la fois dans des conditions écologiques difficiles mais aussi lors de la colonisation chronique des reins.

Methods

Nous avons mis au point une méthode pour cultiver le biofilm des leptospires in vitro dans une plaque 96 puits. Après 4 semaines, la formation du biofilm a été quantifiée à l’aide d’une méthode interne d’analyse d’images basée sur des images optiques à contraste de phase. Pour identifier les gènes des leptospires régulant la formation du biofilm, nous avons quantifié l’altération on l’augmentation de la capacité de mutants, générés par mutagenèse insertionnelle par transposition, à produire un biofilm. Nous avons ensuite étudié l’infectiosité des mutants dans un modèle hamster (hôte sensible), tandis que la capacité de colonisation rénale a été éprouvé dans un modèle souris (hôte réservoir). En parallèle, la protection vis-à-vis de stress environnementaux (T°, lumière UV, NaCl) conférée par le biofilm à ces mutants a été évaluée à l’aide d’un test de viabilité cellulaire (Alamar blue assay). Enfin, des lectines fluorescentes ont été utilisées pour visualiser in situ la présence et la distribution des exo-polysaccharides présents dans le biofilm des Leptospires.

Results

En examinant le phénotype de mutants déficients, nous avons identifié la voie de signalisation du c-di-GMP comme un régulateur majeur dans la formation du biofilm. En effet, lorsque les enzymes de synthèse c-di-GMP (contenant le motif GGDEF) ont subi une perte de fonction, les mutants ont montré une diminution de la production du biofilm et inversement lorsque les enzymes de dégradation du c-di-GMP (contenant le motif HD-GYP) sont altérées, les mutants ont développé une capacité accrue à produire du biofilm. Parallèlement, nous avons mis en évidence qu’un mutant défectueux pour une aldo-kéto-réductase impliquée dans le métabolisme des glucides, présente également une capacité réduite à produire du biofilm.

Nous avons ensuite étudié la pertinence écologique du biofilm produit par les leptospires. La mesure de l’infectiosité des mutants chez des hamsters montre que les mutants présentant une capacité altérée à produire du biofilm sont plus virulents que les mutants présentant une production accrue de biofilm. Dans un modèle de colonisation chronique des reins chez la souris, la charge d’excrétion urinaire des leptospires est plus élevée pour les mutants produisant peu de biofilm que chez leurs homologues. Enfin, un effet protecteur sur la viabilité cellulaire a été observé pour les mutants produisant plus de biofilm lorsqu’ils sont exposés à des doses élevées de sel (NaCl), d’ultraviolet et des températures extrêmes. Nous avons observé que la viabilité est potentialisée de manière dose-dépendante à la production de biofilm.

Enfin, l’emploi de lectines fluorescentes a permis une caractérisation préliminaire de la composition du biofilm, mettant en évidence la présence d’ x-d-glucopyranosyl ainsi que de résidus de x-mannopyranosyl et de x-glucopyranosyl.

Perspectives

Ces travaux ont révélé que, même s’il ne semble pas nécessaire pour l’infection de l’hôte, le biofilm améliore la survie des leptospires dans des conditions environnementales défavorables, ce qui contribue probablement à leur persistance dans l’environnement.

Les données issues de ces travaux pourraient suggérer des stratégies visant à altérer la production et l’organisation du biofilm bactérien, rendant ainsi les leptospires accessibles au système immunitaire ou à des conditions écologiques défavorables. Ces approches ouvriraient ainsi de nouvelles voies de prévention du risque environnemental de contamination par des leptospires.

Valorisation 

Thibeaux R, Soupé-Gilbert ME, Picardeau M, Goarant C. 2017. Biofilm of pathogenic Leptospira: A compromise between virulence and environmental survival? Présentation orale à la conférence de l’ILS, Palmerston North, NZ, November 2017.

Diversité des leptospires en Nouvelle-Calédonie

Une biodiversité des leptospires inattendue dans les sols de Nouvelle-Calédonie
Principal investigateur Cyrille Goarant
Point Focal IPNC Roman Thibeaux, Cyrille Goarant
Collaborateurs IPNC Marie-Estelle Soupé-Gilbert, Dominique Girault, Emilie Bierque
Autres Collaborateurs Mathieu Picardeau, IP Paris,

Gregorio Iraola and Ignacio Ferres, IP Montevideo

Michael Meyer et Anthony Douyère, Université de la Nouvelle-Calédonie

Anna Rettinger, Ludwig Maximilian University of Munich, Munich

Budget 3000 € Budget devoted to IPNC : NA
Financement IPNC
Agenda Début: 2016 Fin: 2018

Contexte

Suite à la mise en évidence de la survie environnementale des leptospires pathogènes sur des sites de contamination humaine en Nouvelle-Calédonie, des isolements de Leptospira ont été entrepris.

Les souches infectantes n’ont pas été ré-isolées de l’environnement, mais un nombre important d’isolats a toutefois été obtenu. Les difficultés d’identification (MALDI-TOF, séquençage ARNr 16S) nous ont amené à suspecter des espèces nouvelles et à entreprendre le séquençage de leur génome complet.

Objectifs

Réaliser une étude génomique des leptospires isolés des sols Calédoniens.

Méthodes

Les isolements ont été réalisés sur le terrain à partir de prélèvements de sols ou d’eau. Les cultures liquides en milieu EMJH sont supplémentées avec une combinaison d’antibiotiques décrite pour sélectionner la croissance des leptospires (Chakraborty et al, 2011). Les cultures sont ensuite étalées sur du milieu EMJH gélosé pour l’isolement.

Les isolats sont identifiés au MALDI-TOF et par séquençage de leur génome complet. Les souches des clusters pathogène et intermédiaire sont testées en modèle animal.

Résultats

Plus de 100 isolats environnementaux ont été obtenus. Les 26 premières souches pour lesquelles le génome complet a été séquencé ont permis de montrer la présence de 12 nouvelles espèces : 3 dans le cluster des pathogènes, 5 dans les intermédiaires et 4 saprophytes.

Les souches du cluster des pathogènes se sont montrées incapables de provoquer une infection aigue chez le hamster ou un portage rénal chez la souris.

Une comparaison détaillée des core génomes et des génomes accessoires supporte l’hypothèse d’un groupe polyphylétique de leptospires peu virulents au sein du cluster des pathogènes. Ce résultat suggère, en terme d’évolution, que la virulence a été acquise indépendamment dans les deux clades pathogènes et intermédiaires.

Les résultats obtenus lors des identifications sur le MALDI-ToF confirment la valeur de cet outil pour l’identification des isolats de leptospires au niveau spécifique. La base de données de spectres de référence a été rendue publique dans le cadre d’une des publications.

Perspectives

La meilleure connaissance de la biodiversité des leptospires telluriques en Nouvelle-Calédonie contribuera d’une part à mieux comprendre l’écologie de ces bactéries. D’autre part, la disponibilité de leurs génomes complets permettra aussi d’améliorer les outils de diagnostic moléculaire de la leptospirose humaine et animale.

Les résultats préliminaires des autres isolats suggèrent d’autres nouvelles espèces.

Valorisation 

Thibeaux R, Iraola G, Ferrés I, Bierque E, Girault D, Soupé-Gilbert ME, Picardeau M, Goarant C, 2018. Deciphering the unexplored Leptospira diversity from soils uncovers genomic evolution to virulence. Microbial Genomics 4: 000144.

Communication grand public par l’Institut Pasteur

Thibeaux R, Iraola G, Ferrés I, Bierque E, Girault D, Soupé-Gilbert ME, Picardeau M, Goarant C. Of soils, Leptospira and humans. Présentation orale à la conférence de l’ILS, Palmerston North, NZ, November 2017.

Thibeaux R, Girault D, Bierque E, Soupé-Gilbert ME, Rettinger A, Douyere A, Meyer M, Iraola G, Picardeau M, Goarant C, 2018. Biodiversity of environmental Leptospira: improving identification and revisiting the diagnosis. Front. Microbiol. 9: 816.

Communication grand public par l’Institut Pasteur